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甲醛变性电泳检测RNA完整性

时间:2012-3-1 14:43:23作者:admin
甲醛变性电泳检测RNA完整性

  
  一、材料、试剂和仪器
  
  1、材料:植物总RNA5-10μg
  
  2、试剂:
  
  1)加样运载缓冲液(Loadingbuffer)
  
  50%甘油
  
  1mmol/LEDTA(pH8.0)
  
  0.25%溴酚蓝
  
  25%二甲苯氰FF
  
  2)10×TAEBuffer
  
  3)5×甲醛凝胶电泳缓冲液:
  
  0.1mol/LMOPs(pH7.0)
  
  40mmol/L乙酸钠
  
  5mmol/LDETA(pH8.0)
  
  4)甲醛,甲酰胺
  
  3、仪器:电泳装置,紫外透射观测仪
  
  二、实验程序
  
  1、甲醛变性的琼脂糖(Agarose)凝胶的配制
  
  在250mL的锥形瓶中准确称量2gAgarose(Sigama),再加20mL10×TAEBuffer144mLDEPC处理过的双蒸水,微波炉中化胶,待冷却至50-60EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36mL甲醛,放置一段时间以减少甲醛蒸汽。
  
  2RNA的甲醛变性电泳
  
  1)样品制备
  
  RNA总量10μg
  
  甲醛凝胶电泳缓冲液4μl
  
  甲醛3.5μl
  
  甲酰胺10μl
  
  加入无菌离心管中混合,95水浴变性2min(5515min),取出后放入冰中冷却。
  
  2)加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三:增大样品密度,以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,便于加样操作;能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以0.5XTBE作电泳液时,溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长300bp的双链线状DNA相同,而二甲苯氰FF的泳动速率与长4kb的双链线状DNA相同。)
  
  3)将胶板浸没在甲醛凝胶电泳缓冲液中,点样前5V/cm预跑5min。点样后3-4V/cm电泳。
  
  4)电泳结束后(溴苯酚蓝迁移到约8cm),紫外灯下观察,照相

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