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液相芯片技术的原理与应用进展
时间:2012-3-1 17:53:45来源:未知 作者:admin 点击:497,1,0次

液相芯片,也称为微球体悬浮芯片(suspension array,liquid chip),是基于xMAP(flexible MultiAnalyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台,它是在不同荧光编码的微球上进行抗原抗体、酶底物、配体受体的结合反应及核酸杂交反应,通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的,一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应,是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。迄今为止十年时间,全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域,该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具,也是最早通过美国食品与药物管理局(FDA)认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。

  1  液相芯片技术的原理

  液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球(直径5.5~5.6 μm)为主要基质构成,每种微球上固定有不同的探针分子,将这些微球悬浮于一个液相体系中,就构成了一个液相芯片系统,利用这个系统可以对同一个样品中的多种不同分子同时进行检测,这种被称之为xMAP的检测技术是1997年由美国Luminex公司开发出来的。

  在液相系统中,为了区分不同的探针,每一种固定有探针的微球都有一个独特的色彩编号,或称荧光编码。在微球制造过程中掺入了红色和橙色两种荧光染料(这两种染料各有10种不同区分),从而把微球分为100种不同的颜色,形成一个具有独特光谱地址的含有100种不同微球的阵列。不同颜色微球在分类激光激发下产生的荧光互不相同,这种分类荧光是识别不同微球的唯一途径。利用这100种微球,可以分别标记上100种不同的探针分子。

    检测时先后加入样品和报告分子与标记微球反应,样品中的目的分子(待检测的抗原或抗体、生物素标记的靶核酸片段、酶等)能够与探针和报告分子特异性结合,使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白,随后利用仪器(如Luminex 100)对微球进行检测和结果分析。Luminex 100采用微流技术使微球快速单列通过检测通道,并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类,从而鉴定各个不同的反应类型(即定性);绿色激光可确定微球上结合的报告荧光分子的数量,从而确定微球上结合的目的分子的数量(即定量)。因此,通过红绿双色激光的同时检测,完成对反应的实时、定性和定量分析。

    2  液相芯片技术的优点

  液相芯片技术最突出的优点在于:仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子,即多重检测(multiplexing)。具体说来,与常规免疫学或核酸检测方法相比,液相芯片技术具有以下显著优点。

    2.1  高通量

    可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行实时、定性、定量分析。从理论上说,如果不存在交叉反应,检测的通量等于微球的种类数,目前最多可达到100种。这远胜过一次只能检测一个项目的传统免疫分析法。

    2.2  样本用量少

    由于在同一个反应孔中可以同时完成100种不同的生物学反应,所以大大节省了样本用量,少至1μl的样本即可检测,非常适合分析小体积稀有样品。

    2.3  操作简单、快速

    由于是基于液相反应动力学,因此反应速度快,孵育时间比传统的固相检测短。进行免疫学分析时,若使用高亲和力抗体,2~3 h内即完成检测,而核酸杂交分析在PCR扩增后1 h内可得到结果。

    2.4  灵敏度高

    微球表面积大,每个微球上可包被100 000个捕获抗体,如此高密度的捕获抗体保证了能够最大程度地与样本中的抗原分子结合,提高检测灵敏度。最低检测浓度可达到0.1 pg/ml.

    2.5  检测范围广

    可达3~5个数量级(如BioRad公司细胞因子检测试剂盒的检测范围达到0.2~32 000 pg/ml,样品无需浓缩或稀释。

 

    2.6  特异性强

    无需洗涤就能够自行将和微球结合的与未结合的分子区分开来,只读取单个微球上的荧光信号,信噪比好。

    2.7  准确性高

    微球上的报告分子荧光强度与结合的待测分子成正比。由于液相芯片技术的检测范围大,因此不需要象ELISA检测中那样需将样本多倍稀释,从而减小了误差。

    2.8  重复性好

    这是由于:第一,与ELISA依靠酶放大作用的比色读数相比,液相芯片技术中的荧光读值更加直接、稳定、灵敏;第二,每种微球检测100个,最终取荧光强度的中值作为结果,这相当于对每个样本重复检测了100次,而ELISA仅为双复孔或三复孔,因此液相芯片检测结果的准确性和重复性是ELISA无法比拟的。

    2.9  费用低

    同时检测一个样本中的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动(比ELISA法低10~100倍),降低检测成本,同时还提高了分析效率,仅需少量样本即可获得大量信息。目前同时检测10项细胞因子的液相芯片试剂的费用大约为$1300/96孔($130/项/96孔),这比检测单项指标的ELISA试剂的成本($500/项/96孔)低得多,而且还可随检测指标的增加而进一步降低费用。

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